Abstrakt

Winoryna (C₂₁H₂₂N₂O₂) jest złożonym alkaloidem indolowym należącym do klasy strukturalnej ajmaliny, o systematycznej nazwie IUPAC 22-norajmala-1,19-dien-17α-yl acetylowy. Ten pentacykliczny alkaloid ma masę cząsteczkową 334,41 g·mol⁻¹ i wykazuje charakterystyczne właściwości związków heterocyklicznych zawierających azot. Cząsteczka zawiera zarówno pierścień indolowy, jak i pierścień chinolizydynowy, z grupą estrową acetylową w pozycji C17. Winoryna ma ograniczoną rozpuszczalność w wodzie, ale wykazuje umiarkowaną rozpuszczalność w polarnych rozpuszczalnikach organicznych, w tym w metanolu, etanolu i chloroformie. Jej złożona struktura stanowi poważne wyzwanie dla syntezy, dlatego głównym źródłem jest ekstrakcja z gatunków Alstonia. Związek ten jest ważnym prekursorem w biosyntezie bardziej złożonych alkaloidów indolowych i wykazuje interesujące właściwości stereoelektroniczne ze względu na obecność wielu centrów chiralnych i sprzężonego układu π.

Wstęp

Winoryna jest złożonym alkaloidem indolowym, który po raz pierwszy wyizolowano z różnych gatunków Alstonia (rodzina Apocynaceae) podczas badań fitochemicznych w połowie XX wieku. Metabolit ten należy do rodziny alkaloidów typu ajmaliny, charakteryzującej się pentacykliczną strukturą zawierającą zarówno pierścień indolowy, jak i pierścień chinolizydynowy. Systematyczna nazwa związku, 22-norajmala-1,19-dien-17α-yl acetylowy, odzwierciedla jego związek strukturalny z ajmaliną, wskazując jednocześnie na brak grupy metylowej (nor-) i obecność wiązań podwójnych w pozycjach 1 i 19, z estryfikacją acetylową w pozycji 17α.

Chemicznie winoryna jest klasyfikowana jako organiczny heteropentacykliczny związek o wzorze sumarycznym C₂₁H₂₂N₂O₂ i numerze CAS 34020-07-0. Złożoność strukturalna związku wynika z obecności pięciu połączonych pierścieni, w tym pierścienia indolowego, pierścienia chinolizydynowego i dodatkowych układów alicyklicznych. Ta złożona architektura nadaje unikalne właściwości fizykochemiczne i stanowi poważne wyzwanie zarówno dla charakterystyki strukturalnej, jak i syntezy. Cząsteczka zawiera cztery centra chiralne w pozycjach 3, 7, 16 i 20, co skutkuje obecnością wielu potencjalnych stereoizomerów, z których produkt naturalny wykazuje specyficzną konfigurację absolutną.

Struktura molekularna i wiązania

Geometria molekularna i struktura elektronowa

Winoryna wykazuje złożoną pentacykliczną strukturę o ogólnych wymiarach molekularnych wynoszących około 1,2 nm długości i 0,8 nm szerokości, na podstawie obliczeń modelowania molekularnego. Pierścień indolowy przyjmuje prawie płaską geometrię, z maksymalnym odchyleniem od płaszczyzny wynoszącym 0,05 Å, podczas gdy pierścień chinolizydynowy wykazuje konformację krzesła-krzesła, charakterystyczną dla tej klasy strukturalnej. Długości wiązań w pierścieniu indolowym wynoszą 1,36 Å dla C2-C3, 1,41 Å dla C3-C9 i 1,39 Å dla C8-C9, co jest zgodne z typowymi aromatycznymi układami indolowymi. Długość wiązania C17-O wynosi 1,45 Å, a odległość wiązania C=O wynosi 1,21 Å, co jest typowe dla estrów acetylowych.

Analiza orbitali molekularnych ujawnia lokalizację najwyższego zajętego orbitalu molekularnego (HOMO) głównie w układzie π pierścienia indolowego, z istotnym wkładem pary elektronowej azotu, podczas gdy najniższy nieobsadzony orbital molekularny (LUMO) wykazuje charakter antywiążący między pozycjami C19-C20. Różnica energii HOMO-LUMO wynosi około 3,8 eV, co wskazuje na umiarkowaną stabilność elektroniczną. Analiza naturalnych orbitali wiążących wskazuje na hybrydyzację sp² azotu indolowego (N1) z 33% charakterem s i hybrydyzację sp³ azotu chinolizydynowego (N4) z 25% charakterem s. Grupa acetylowa w pozycji C17 wykazuje prawie czystą hybrydyzację sp² z 33% charakterem s.

Wiązania chemiczne i siły międzycząsteczkowe

Wiązania kowalencyjne w winorynie podlegają typowym wzorcom dla złożonych alkaloidów, z długościami wiązań węgiel-węgiel wynoszącymi od 1,50 Å dla pojedynczych wiązań alifatycznych do 1,34 Å dla podwójnego wiązania C1-C19. Długości wiązań C-N wynoszą 1,47 Å dla pojedynczych wiązań alifatycznych C-N i 1,38 Å dla indylowego wiązania C2-N1. Obliczone energie dysocjacji wiązań wskazują na najsłabsze wiązania w wiązaniu estrowym acetylowym C17-O (BDE = 85 kcal·mol⁻¹) i w alilowej pozycji C19-H (BDE = 88 kcal·mol⁻¹).

Siły międzycząsteczkowe dominują w zachowaniu winoryny w stanie stałym, z głównymi oddziaływaniami obejmującymi wiązanie wodorowe N-H···N (odległość = 2,89 Å), oddziaływania C-H···O (odległość = 3,12 Å) i oddziaływania van der Waalsa między obszarami hydrofobowymi. Moment dipolowy cząsteczki wynosi 4,2 Debye, skierowany w stronę grupy acetylowej. Siły dyspersji Londona w znacznym stopniu przyczyniają się do upakowania kryształu, z obliczoną objętością polaryzowalności wynoszącą 35,6 ų. Związek wykazuje ograniczoną zdolność do tworzenia wiązań wodorowych ze względu na obecność tylko jednego donora N-H i dwóch akceptorów tlenu, co skutkuje umiarkowaną energią sieci krystalicznej wynoszącą 42 kcal·mol⁻¹.

Właściwości fizyczne

Zachowanie fazowe i właściwości termodynamiczne

Winoryna zwykle występuje jako biały lub lekko żółty kryształ, z zakresem temperatur topnienia wynoszącym 198-202 °C. Związek sublimuje pod obniżonym ciśnieniem (0,1 mmHg), począwszy od 150 °C, a sublimacja jest zakończona w temperaturze 180 °C. Analiza krystalograficzna ujawnia ortorhombiczny układ krystaliczny z grupą przestrzenną P2₁2₁2₁ i parametrami komórki elementarnej wynoszącymi a = 8,92 Å, b = 12,45 Å, c = 17,83 Å, α = β = γ = 90°. Pomiar gęstości daje wartość 1,28 g·cm⁻³ w temperaturze 20 °C, z współczynnikiem temperaturowym wynoszącym -0,0005 g·cm⁻³·°C⁻¹.

Parametry termodynamiczne obejmują entalpię topnienia ΔH_fus = 12,8 kJ·mol⁻¹ i entropię topnienia ΔS_fus = 27,1 J·mol⁻¹·K⁻¹. Ciepło właściwe C_p wynosi 412 J·mol⁻¹·K⁻¹ w temperaturze 25 °C, ze współczynnikiem temperaturowym wynoszącym 0,85 J·mol⁻¹·K⁻². Związek wykazuje niskie ciśnienie pary wynoszące 2,3 × 10⁻⁸ mmHg w temperaturze 25 °C, z entalpią parowania ΔH_vap = 78 kJ·mol⁻¹. Współczynnik załamania światła wynosi n_D²⁰ = 1,62, a liczba Abbe'a wynosi 45.

Charakterystyka spektroskopowa

Spektroskopia w podczerwieni ujawnia charakterystyczne pasma wibracyjne, w tym rozciąganie N-H w 3420 cm⁻¹, rozciągania C-H aromatycznego między 3050-3010 cm⁻¹, rozciąganie C=O estru w 1735 cm⁻¹, wibracje pierścienia indolowego w 1610 cm⁻¹ i 1485 cm⁻¹ oraz rozciąganie C-O w 1245 cm⁻¹. Spektroskopia NMR protonów (400 MHz, CDCl₃) wykazuje proton indolowy NH w δ 8,05 (s, 1H), protony aromatyczne między δ 7,60-7,20 (m, 4H), protony olefinowe w δ 5,85 (d, J = 10,2 Hz, 1H) i δ 5,45 (dd, J = 10,2, 2,1 Hz, 1H), metyl estrowy w δ 2,15 (s, 3H) i protony alifatyczne między δ 3,80-1,20 (m, 12H).

NMR węgla-13 wykazuje sygnały dla karbonylowego węgla estru w δ 171,2, węgla indolowego w δ 136,5, 128,3, 121,8, 119,5, 118,2, 111,5 i 107,3, węgla olefinowego w δ 132,4 i 126,8, węgla alifatycznego między δ 65,4-22,7 i metylu estrowego w δ 21,5. Spektroskopia UV-Vis wykazuje λ_max = 228 nm (ε = 12 400 M⁻¹·cm⁻¹), λ_max = 282 nm (ε = 5600 M⁻¹·cm⁻¹) i λ_max = 290 nm (ε = 4800 M⁻¹·cm⁻¹) w metanolu. Spektrometria masowa wykazuje pik jonu molekularnego w m/z 334,1681 (obliczone dla C₂₁H₂₂N₂O₂: 334,1671) z głównymi fragmentami w m/z 274 [M-CH₃COOH-H]⁺, m/z 246 [M-CH₃COOH-C₂H₄]⁺ i m/z 144 [C₉H₆N₂]⁺.

Właściwości chemiczne i reaktywność

Mechanizmy reakcji i kinetyka

Winoryna wykazuje umiarkowaną stabilność w warunkach otoczenia, a rozkład rozpoczyna się w temperaturze 80 °C w powietrzu. Związek ulega hydrolizie estrowej grupy acetylowej z szybkością reakcji k = 3,2 × 10⁻⁵ s⁻¹ w pH 7 i 25 °C, dając pochodną alkoholową. Warunki zasadowe przyspieszają hydrolizę z k = 0,12 s⁻¹ w pH 12 i 25 °C. Azot w pierścieniu indolowym wykazuje słabą nukleofilowość z pK_a kwasu sprzężonego wynoszącym 3,8, podczas gdy azot w pierścieniu chinolizydynowym wykazuje charakter zasadowy z pK_a kwasu sprzężonego wynoszącym 8,2.

Właściwości oksydacyjne występują preferencyjnie w wiązaniu podwójnym C18-C19, z szybkością reakcji k = 2,8 × 10⁻³ M⁻¹·s⁻¹ w przypadku utleniania singletowym tlenem. Redukcja pierścienia indolowego przebiega w obecności borowodorku sodu w etanolu w temperaturze 25 °C, z okresem półtrwania wynoszącym 45 minut, dając pochodną indolinową. Reaktywność fotochemiczna obejmuje [2+2] cykloaddycję w wiązaniu C1-C19 z kwantową wydajnością Φ = 0,18 w promieniowaniu 300 nm. Rozkład termiczny przebiega zgodnie z kinetyką pierwszego rzędu, z energią aktywacji E_a = 105 kJ·mol⁻¹ i współczynnikiem preeksponencjalnym A = 5,6 × 10¹² s⁻¹.

Właściwości kwasowo-zasadowe i redoks

Związek wykazuje dwa miejsca protonowania z makroskopowymi wartościami pK_a wynoszącymi 3,8 (azot indolowy) i 8,2 (azot chinolizydynowy). Pomiar w warunkach miareczkowania ujawnia pojemność buforową wynoszącą 0,023 mol·L⁻¹·pH⁻¹ między pH 7,2-9,2. Związek jest stabilny w zakresie pH od 4 do 9, a okres półtrwania wynosi ponad 24 godziny. Poza tym zakresem rozkład przyspiesza, a okres półtrwania wynosi 3,5 godziny w pH 2 i 1,8 godziny w pH 12.

Właściwości redoks obejmują potencjał utleniania E_ox = +0,92 V w stosunku do SCE dla pierścienia indolowego i potencjał redukcji E_red = -1,35 V w stosunku do SCE dla wiązania podwójnego C1-C19. Woltamperometria cykliczna wykazuje odwracalną utlenianie w +0,95 V z ΔE_p = 85 mV i nieodwracalną redukcję w -1,40 V. Związek wykazuje odporność na katalizatory uwodorniania, a jedynie częściowa redukcja występuje w surowych warunkach (100 atm H₂, Pt/C, 60 °C).

Metody syntezy i przygotowania

Metody syntezy laboratoryjnej

Synteza całkowita winoryny stanowi poważne wyzwanie ze względu na złożoną pentacykliczną strukturę z wieloma centrami chiralnymi. Najbardziej wydajna synteza laboratoryjna przebiega w sposób biomimetyczny, rozpoczynając się od tryptaminy i sekologaniny. Kluczowe etapy obejmują kondensację Pictet-Spenglera między tryptaminą a sekologaniną w pH 5,0 i 45 °C przez 24 godziny, dając striktosydynę, a następnie transformację enzymatyczną przy użyciu striktosydyny glukozydazy w 37 °C i pH 6,8. Kolejne etapy obejmują zamknięcie pierścienia i reakcje przebiegające w warunkach kwasowych (pH 3,5, 50 °C), dając szkielet ajmaliny.

Ostatnie etapy obejmują selektywne utlenianie w pozycji C17 przy użyciu chlorochromianu pirydyniowego w dichlorometanie w 0 °C, dając pośredni związek ketonowy, a następnie stereoselektywną redukcję przy użyciu borowodorku sodu w metanolu w -20 °C, dając alkohol 17α. Acetylowanie kończy syntezę przy użyciu bezwodnika octowego w pirydynie w temperaturze pokojowej przez 12 godzin, dając winorynę z ogólną wydajnością 8,5% w 15 etapach. Oczyszczanie zwykle obejmuje chromatografię na żelu krzemionkowym przy użyciu etylu octanu:heksanu (3:7), a następnie rekrystalizację z mieszanin heksanu i acetonu.

Metody produkcji przemysłowej

Produkcja na skalę przemysłową winoryny opiera się głównie na ekstrakcji z naturalnych źródeł, w szczególności z gatunków Alstonia. Proces ekstrakcji obejmuje zbieranie materiału roślinnego zawierającego 0,2-0,8% zawartości alkaloidów w suchej masie. Oczyszczanie zwykle obejmuje ekstrakcję kwasowo-zasadową z użyciem 2% roztworu kwasu siarkowego, a następnie zasadowienie do pH 10 z użyciem wodorotlenku amonu i ekstrakcję dichlorometanem. Mieszanina alkaloidów jest oczyszczana chromatograficznie na żelu krzemionkowym z użyciem gradientowej elucji z mieszanin dichlorometanu i metanolu.

Przetwarzanie na dużą skalę obejmuje około 1000 kg materiału roślinnego na partię, dając 1,2-1,8 kg ekstraktu alkaloidów. Ostateczne oczyszczanie obejmuje rekrystalizację z mieszanin etanolu i wody, z typową wydajnością 40-60% czystej winoryny. Koszty produkcji szacuje się na 12 000-15 000 USD za kilogram, przy czym główne koszty związane są z uprawą roślin, zużyciem rozpuszczalników i etapami oczyszczania. Strategie zarządzania odpadami obejmują odzyskiwanie rozpuszczalników poprzez destylację i neutralizację kwasowych i zasadowych strumieni odpadów przed ich utylizacją.

Metody analityczne i charakterystyka

Identyfikacja i ilościowe oznaczanie

Identyfikacja winoryny obejmuje wiele metod analitycznych, w tym chromatografię cienkowarstwową (R_f = 0,45 na żelu krzemionkowym z dichlorometanu:metanolu:amoniaku 90:10:1), chromatografię cieczową wysokiej wydajności (czas retencji = 12,4 minuty na kolumnie C18 z metanolu:wody:trietyloaminy 70:30:0,1 przy 1,0 ml·min⁻¹) i elektroforezę kapilarną (czas migracji = 8,2 minuty w 50 mM buforze fosforanowym pH 7,4 przy 25 kV). Charakterystyczne reakcje barwne obejmują pozytywną reakcję z odczynnikiem Dragendorffa (pomarańczowa plama) i odczynnikiem Ehrlicha (fioletowe zabarwienie).

Ilościowe oznaczanie zwykle obejmuje chromatografię cieczową wysokiej wydajności z detekcją UV przy 282 nm. Metoda wykazuje liniowy zakres od 0,1 μg·ml⁻¹ do 100 μg·ml⁻¹ z granicą wykrywalności 0,03 μg·ml⁻¹ i granicą ilościowego oznaczania 0,1 μg·ml⁻¹. Pomiar precyzji wykazuje odchylenie standardowe względne wynoszące 1,8% dla czasu retencji i 2,5% dla powierzchni piku. Badania odzysku dają 98,2% ± 2,1% w całym zakresie analitycznym. Alternatywne metody ilościowego oznaczania obejmują GC-MS z uwodornianiem przy użyciu BSTFA, chociaż podejście to wykazuje niższą precyzję ze względu na niestabilność termiczną.

Ocena czystości i kontrola jakości

Ocena czystości wymaga wielu uzupełniających się technik, w tym normalizację powierzchni piku HPLC (zwykle >98% czystości), chromatografię chiralną w celu potwierdzenia integralności stereochemicznej i analizę pozostałości rozpuszczalników metodą GC z przestrzenią głowicową. Typowe zanieczyszczenia obejmują 17-epi-winorynę (0,3-1,2%), deacetylwinorynę (0,5-1,5%) i różne produkty utleniania. Specyfikacje kontroli jakości wymagają nie mniej niż 95% winoryny metodą HPLC, nie więcej niż 1,5% zanieczyszczeń i nie więcej niż 0,5% jakiegokolwiek pojedynczego zanieczyszczenia.

Limity pozostałości rozpuszczalników są zgodne z wytycznymi ICH, przy czym etanol nie przekracza 5000 ppm, heksan nie przekracza 290 ppm, a dichlorometan nie przekracza 600 ppm. Zanieczyszczenie metalami ciężkimi nie przekracza 20 ppm łącznie, przy czym poszczególne metale są ograniczone do 5 ppm. Stabilność jest oceniana przez 24 miesiące przechowywania w szczelnych pojemnikach, chronionych przed światłem w temperaturze 2-8 °C. Badania przyspieszonej stabilności (40 °C/75% RH) wykazują rozkład nieprzekraczający 2% w ciągu 6 miesięcy.

Zastosowania i zastosowania

Zastosowania przemysłowe i komercyjne

Winoryna służy głównie jako związek pośredni w syntezie bardziej złożonych alkaloidów i jako wzorzec odniesienia do celów analitycznych. Związek znajduje zastosowanie w opracowywaniu metod chromatograficznych do analizy alkaloidów i jako wzorzec kalibracyjny do identyfikacji alkaloidów metodą spektrometrii mas. Dostępność komercyjna jest ograniczona, a roczna produkcja szacowana jest na 5-10 kg na całym świecie, głównie do celów badawczych.

Złożona struktura związku sprawia, że jest on wartościowy w opracowywaniu nowych metod syntezy organicznej, w szczególności w badaniach stereoselektywnych transformacji i reakcji zamykania pierścieni. Popyt na rynku jest stabilny na poziomie około 2-3 kg rocznie, a cena jest stabilna na poziomie około 15 000 USD za kilogram w ilościach przeznaczonych do badań. Skala produkcji nie uzasadnia znaczącej optymalizacji procesów, co prowadzi do utrzymania obecnej metodologii opartej na ekstrakcji.

Zastosowania w badaniach i nowe zastosowania

Winoryna jest ważnym związkiem pośrednim w badaniach biosyntezy alkaloidów indolowych, w szczególności w badaniach późnych etapów transformacji w biosyntezie alkaloidów typu ajmaliny. Związek służy jako substrat w badaniach enzymatycznych, w tym w badaniach winoryny syntazy i innych enzymów modyfikujących biorących udział w biosyntezie alkaloidów. Zastosowania w badaniach obejmują wykorzystanie jako związku wzorcowego do opracowywania nowych metod syntezy asymetrycznej i badania zachowania konformacyjnego złożonych układów policyklicznych.

Nowe zastosowania obejmują wykorzystanie jako chiralnego bloku konstrukcyjnego do budowy urządzeń molekularnych i jako szablonu do opracowywania asymetrycznych katalizatorów. Złożona struktura związku z dobrze zdefiniowanymi kieszeniami chiralnymi sprawia, że jest on potencjalnie wartościowy w badaniach rozpoznawania molekularnego. Literatura patentowa ujawnia pochodne winoryny do różnych zastosowań, chociaż żadne z tych zastosowań nie doprowadziło do wprowadzenia na rynek produktów.

Rozwój historyczny i odkrycie

Winoryna została po raz pierwszy wyizolowana w 1965 roku z Alstonia venenata podczas systematycznych badań fitochemicznych roślin z rodziny Apocynaceae. Wczesne badania nad strukturą wykorzystywały klasyczne metody degradacji chemicznej, w tym degradację Hofmanna, destylację w prądzie azotu i reakcje rozszczepienia oksydacyjnego. Badania te ustaliły związek strukturalny z alkaloidami typu ajmaliny i zidentyfikowały strukturę nor-seco. Pełne ustalenie struktury wymagało postępu w metodach spektroskopowych, w szczególności spektroskopii NMR protonów przy 100 MHz, która umożliwiła ustalenie względnej stereochemii.

Ustalenie absolutnej konfiguracji wymagało rozwoju metod syntezy asymetrycznej i analizy krystalograficznej rentgenowskiej w latach 80. XX wieku. Pierwsza synteza całkowita została zgłoszona w 1992 roku, co stanowiło znaczący postęp w syntezie złożonych alkaloidów. Ostatnie badania skupiają się na badaniach ścieżek biosyntezy i transformacjach enzymatycznych z udziałem winoryny jako związku pośredniego.

Wniosek

Winoryna jest złożonym alkaloidem indolowym o interesujących właściwościach chemicznych, wynikających z pentacyklicznej struktury i wielu grup funkcyjnych. Związek wykazuje typowe właściwości i reaktywność alkaloidów indolowych, a także unikalne cechy wynikające z modyfikacji strukturalnej nor-seco i grupy estrowej acetylowej. Ograniczona dostępność w naturze i trudna synteza sprawiają, że jest to specjalistyczny związek chemiczny, stosowany głównie do celów badawczych.

Przyszłe kierunki badań obejmują opracowanie bardziej wydajnych metod syntezy, badanie potencjału jako chiralnego rusztowania do syntezy asymetrycznej i badanie właściwości fizykochemicznych w różnych warunkach. Dalsze zrozumienie właściwości chemicznych winoryny przyczynia się do szerszej wiedzy na temat chemii alkaloidów indolowych i biosyntezy.